 | Nella microscopia in fluorescenza, i preparati vengono trattati con reagenti speciali, le cui singole molecole sono in grado di assorbire la luce per un tempo eccezionalmente breve – generalmente miliardesimi di secondo – e di emetterla nuovamente. La luce emessa ha però una lunghezza d'onda che tende leggermente verso il rosso. Se, ad esempio, viene assorbita luce blu, immediatamente dopo viene emessa luce verde. Il verde viene convertito in giallo, il giallo in rosso-arancione e l'invisibile luce ultravioletta in luce visibile. Questo fenomeno è stato osservato dal fisico Stockes e porta il suo nome. In fluorescenza, la lunghezza d'onda della luce emessa è più lunga di circa 20 ÷ 50 nanometri della luce d'eccitazione assorbita.
Le molecole di fluorescenza possono assorbire solamente la luce di una certa lunghezza d'onda. I diversi fluorocromi presentano ognuno un proprio spettro di assorbimento specifico, in funzione della struttura interna delle molecole di fluorescenza e, a volte, anche del loro ambiente circostante. Inoltre, non viene assorbito ogni fotone, ma solo una parte della sua luce irradiante. I fotoni assorbiti non vengono poi emessi nella loro totalità: i buoni marcatori di fluorescenza hanno un'alta "resa fotonica" – un termine che descrive il rapporto tra i fotoni emessi e quelli assorbiti.
In microscopia quest'effetto è molto utile: un preparato marcato in questo modo viene illuminato con pura luce blu filtrata ed osservato usando un filtro di sbarramento non trasparente per la luce blu, ma che trasmette la luce rossa, gialla e verde a grande lunghezza d'onda. Le strutture marcate con molecole fluorescenti – ad esempio parti del citoscheletro – s'illuminano di verde contro un fondo scuro.
Agli inizi della microscopia in fluorescenza, i preparati venivano colorati per lo più con fluorocromi non specifici. Questo tipo di marcatura risulta generalmente chiaro, dato che i legami delle numerose molecole di fluorescenza avvengono ovunque. Oggi, i metodi di marcatura sono diventati molto più specifici. Ciò è stato possibile accoppiando permanentemente sostanze biologiche come gli anticorpi, alle molecole di fluorescenza. Allora non è più il fluorocromo a decidere il punto di legame ma la molecola biologicamente attiva. Normalmente, ciò conduce ad immagini di fluorescenza più deboli – perchè viene legato molto meno "colorante". Le informazioni ottenute – ad esempio nella diagnosi delle malattie – sono molto più precise.
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| un campione marcato con fluoresceina viene illuminato in luce riflessa, con intensa luce blu. | se il campione viene osservato attraverso un filtro di sbarramento, la luce blu d’eccitazione non è più visibile. E’ invece chiaramente visibile sul campione la luce gialla della fluorescenza. |
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